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    30. Diferenciacion. Introducción. Totipotencia. Polaridad. Regulación génica. Regulación intercelular. Regulación hormonal. Técnicas de selección. Transformaciones tumorales. Metabolitos secundarios. Áreas de aplicación



    30. DIFERENCIACION. Introducción. Totipotencia. Polaridad. Regulación génica. Regulación intercelular. Regulación hormonal. Técnicas de selección. Transformaciones tumorales. Metabolitos secundarios. Áreas de aplicación. Embriogénesis en dicotiledóneas.
    OBJETIVOS


    • Introducir al alumno en el campo teórico y aplicado de la biotecnología

    • Compartir ideas generales sobre le complejo proceso de la diferenciación vegetal.

    • Carácter multidisciplinar de la biología del desarrollo.



    Introducción.
    La diferenciación se basa en la EXPRESIÓN GÉNICA DIFERENCIAL a partir de núcleos geneticamente idénticos.


    • los factores ambientales.

    • la sensibilidad celular.

    • la relación de concentraciones de reguladores.

    Todo ello origina lo que se conoce como POLARIDAD CELULAR, que no es más que la existencia de un microambiente distinto en cada coordenada permitiendo así la expresión génica diferencial. La polaridad posee las siguientes características:



    • En los tejidos del tallo y la raíz es muy estable y no es fácilmente reversible.

    • La polaridad persiste incluso después de periodos de dormición, cuando la actividad metabólica es muy baja.

    • La polaridad de un tejido refleja aparentemente la polaridad de células individuales.

    Para la diferenciación se tienen en cuenta 4 premisas:



    • ningún entorno es uniforme.

    • nunca implica pérdida irreversible de la información génica.

    • las células vegetales son polipotentes: la totipotencia define a las células vegetales como unidades capaces de adaptar cualquier pauta de diferenciación atendiendo a las señales recibidas (no precisa información materna como ocurre en animales), como esto no es exacto en todas las poblaciones celulares, es mejor emplear el concepto de polipotencia.

    • la organogénesis vegetal

      • es ilimitada, reversible y repetitiva.

      • Está condicionada por reguladores del crecimiento y la nutrición mineral.

    Las aplicaciones biotecnológicas y las técnicas tradicionales de propagación se basan en estos fundamentos para llevar a cabo la producción de planta.


    La agricultura es la actividad más importante llevada a cabo por la humanidad y una de las primeras etapas fue la domesticación de plantas específicas para su cultivo, lo cual supone el reconocimiento de que una especie vegetal determinada tiene algo que ofrecer. Como resultado, durante miles de años se ha producido la selección de mejores plantas, lo que ha sido un proceso continuo llevado a cabo tanto de manera consciente como inconsciente.

    No obstante, la tecnología actual de selección vegetal se ha desarrollado durante el último siglo y se basa en el mejor conocimiento de la base genética de los caracteres agronómicos y, en particular, en la aplicación de los principios genéticos clásicos de Mendel. Sin embargo, el éxito en el logro de los objetivos de la selección depende también del conocimiento de la fisiología, bioquímica y patología vegetal.


    El propósito de la selección de plantas agrícolas mejoradas ha permanecido relativamente constante, seleccionándose por su:

    • Facilidad de cultivo.

    • Mayor rendimiento.

    • Calidad apropiada

    • Resistencia a plagas, enfermedades y estrés ambiental.


    Las técnicas tradicionales de selección:

    • Están basadas en:

      • Esquejado.

      • Injertos.

      • Unidades de dispersión: como son las semillas, los bulbos y los tubérculos.

    • Poseen limitaciones, como son:

    • Ligamiento genético: el hecho de que determinados genes se hereden de manera asociada porque se encuentran situados muy próximos en el mismo cromosoma crea una serie de dificultades.

    • Poligenes procedentes de poblaciones silvestres: es difícil utilizarlos debido al enorme número de genes que habría que ordenar, incluso si no hubiera ligamiento.

    • Caracteres complejos: resulta difícil calcular la cantidad de los mismos, identificar sus componentes específicos y averiguar la genética de dichos componentes de manera que se puedan seleccionar.

    • Identificación de mutantes útiles: su frecuencia de aparición espontánea es muy baja y esto dificulta su identificación, especialmente porque suelen ser recesivos.

    • Escala temporal: en ralentiza la producción de variedades mejoradas; por ejemplo en árboles frutales.

    Algunos de estos factores que limitan el proceso de la mejora vegetal pueden superarse más rápidamente aplicando la nueva serie de técnicas de la biología molecular y celular. La biotecnología vegetal tendrá quizá dos importantes efectos a largo plazo:



    • la generación de combinaciones genéticas nuevas.

    • Aumento de nuestro conocimiento de los procesos genéticos reguladores


    La biotecnología vegetal
    Área de la biología que se está expandiendo rápidamente porque es el producto de varias disciplinas que, hasta hace relativamente poco tiempo, se consideraban independientes: la biología molecular, el cultivo de tejidos, la ingeniería química, la patología vegetal y, cada vez más, la economía.

    Esta ciencia cubre la demanda en dos campos de trabajo:


    1 – PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE PLANTA

    Tras un proceso de selección de “individuos plus” o “individuos élite” mediante programas de mejora genética clásica obtenemos múltiples copias idénticas de los genomas óptimos para la respuesta esperada a partir del proceso de CLONACIÓN.

    En teoría podemos tomar cualquier célula, debido a la polipotencia antes comentada, sin embargo; existen preferencias:


    1. podemos partir de poblaciones que aseguran la multiplicación del organismo (células predeterminadas) como ápices meristemáticos o yemas laterales (segmentos nodales) para aumentar exponencialmente su número asegurando la estabilidad. Mediante este proceso también conseguimos:

    - adecuarnos al mercado: producción industrial de planta.

    - mantenimiento del germoplasma (por ejemplo, mediante crioconservación).




    Reguladores

    +

    Nutrientes



    +

    Atmósfera



    →→→→

    Segmentos nodales que están delimitados por la organogénesis Ej.: yemas

    →→→→→

    Aumento del nº de yemas tras 20 días (porque la organogénesis es repetitiva)




    1. partimos de células no predeterminadas para inducir la formación de yemas, raíces, embriones somáticos según la relación de moléculas inductoras (auxina/citoquinina).

    Con el tiempo se ve que existe una tasa de replicación con la que obtenemos una vía de multiplicación clonal que podemos:




      • Mantener: con lo que obtenemos una producción constante e independiente de las condiciones ambientales1.

      • Ralentizar: eliminando reguladores de crecimiento, disminuyendo la temperatura o añadiendo inhibidores.

    El desarrollo de biorreactores ha sido fundamental: nos sirven para llevar a cabo alguna reacción que explantada no resulte económica (producción de metabolitos secundarios, por ejemplo). Es más independiente que la multiplicación clonal y después puede sacarse el material a un medio con auxina2 y obtener una planta entera.



    • Planta clonal certificada: aquella que ha superado pruebas que demuestran su calidad como son la citometría de flujo, utilización de marcadores moleculares, presencia de estabilidad epigenética o ausencia de contaminantes. Además, por el hecho de ser un clon, tiene que ser exactamente igual que el material de partida, lo cual es viable en pocas especies.

    2 – MEJORA DE PLANTA (creación de nuevas variedades):



    1. Mejora no dirigida:

    Ejemplo: hacemos un corte a una hoja y la metemos en un medio con auxina, rápidamente vemos en las zonas de corte que existe una rápida proliferación que provoca:

    • Alta actividad mitótica3 debido a consecutivos ciclos de división celular. En ocasiones el reparto del material genético puede provocar inestabilidad en el genoma (diploidías, aneuploidías...).

    Si comprobamos que alguna de las células obtenidas durante la clonación es genéticamente distinta al parental estamos ante la aparición de una nueva variedad (heteroclones).

    Mediante marcadores podemos estudiar las propiedades que le confiere a la célula esta fuente de variación y así aprovechar la nueva variedad en caso de que sean positivas para ella. (ej: resistencia a virus)



    • Pérdida del patrón de expresión génica diferencial.

    El incremento de la actividad mitótica y la pérdida del patrón de expresión génica producen la desdiferenciación celular que provoca la actividad meristemática de algunas células produciéndose un callo4 que puede dar lugar a 2 vías:

    • Producción de embriones somáticos: de origen unicelular.

    • Producción de tallos5: formados por varias células.




    1. Transgénesis (mejora dirigida)

    Técnica más actual:

    Tomamos una célula muy reactiva con un genoma plus seleccionado y le introducimos genes que se incorporan al germoplasma6 para mejorarlo genéticamente.

    Hoy en día este “trasvase” de genes se lleva a cabo con bombardeo de genes sobre el genoma, ataque de virus o bacterias como Agrobacterium a las plantas.


    Como se puede ver en la imagen, durante el contacto con las células vegetales lesionadas, se transfiere un segmento de DNA del plásmido Ti7 desde la bacteria hasta la célula vegetal, donde se integra en uno o más de sus cromosomas; este DNA transferido o T-DNA contiene los genes denominados “onc”, cuya expresión da como resultado un mayor nivel endógeno de los reguladores de crecimiento vegetal, auxinas y citoquinina. A su vez, estos reguladores estimulan las divisiones celulares que inducen a la formación del tumor.

    Este proceso ocurre normalmente como una parte del proceso infectivo normal de estas bacterias en el suelo, pero los biólogos moleculares lo han empleado como un sistema vector para introducir genes específicos en células vegetales.


    Para ello han tenido que realizar una serie de modificaciones:




    • Eliminación de los oncogenes: porque producen opinas, que son incapaces de generar plantas normales y por tanto no tienen utilidad práctica. Así se obtienen los plásmidos Ti “desarmados”.

    • Se mantienen las secuencias de inserción inicial y final porque son las que inducen la inserción del plásmido;

    • El plásmido es demasiado largo y por eso se separa en 2 sin que esto modifique su capacidad de transferencia (plásmido binario).

    • Inserción de un gen localizador o marcador que se pueda seleccionar, como por ejemplo, alguno que codifique para la resistencia a antibióticos8.

    • Inserción del DNA que queremos transferir a la planta.



    Una vez incorporadas estas mejoras para el aprovechamiento máximo de los sistemas vegetales, estos se someten a procesos de trazabilidad para controlar si el producto obtenido en caso de ir dirigido al consumo humano sea apto e inocuo.



    • Obtención de metabolitos secundarios

    Las proteínas, los carbohidratos y los lípidos se denominan metabolitos primarios por su papel imprescindible para el mantenimiento de la viabilidad de la planta; existen, además otras moléculas que no se consideran esenciales por lo que se llamaron metabolitos secundarios, su estructura es muy diversa y, en general, parece que su conservación a lo largo de la evolución se debe a que confieren ventajas selectivas a los vegetales que las portan.

    Todos los principios inmediatos de medicina y cosmética (por ejemplo) derivan de estos metabolitos secundarios por lo que la obtención de los mismos tiene una gran importancia económica.

    Como lo que nos interesa obtener es la respuesta en la propia planta utilizaríamos nuestro sistema vegetal9 como biorreactor del que se pueden obtener:


    • Productos directos: como el taxol, anticancerígeno que se obtiene del tejo.

    • Mediante la adición de precursores(es decir, unido a síntesis química), síntesis del producto final en su totalidad.

    Algunas características ventajosas de las células vegetales inmovilizadas para la producción a gran escala de metabolitos secundarios:

    • Reutilización de biomasa.

    • Elevadas concentraciones de biomasa.

    • Mejor rendimiento metabólico.

    • Fase de producción relativamente larga en comparación con la fase de crecimiento.

    • Resistencia a lesión por corte.

    • Recolección más sencilla de la biomasa.

    • Equipo más reducido.




    Áreas de aplicación

    1. A corto plazo(3 años):

      • Propagación vegetativa.

      • Eliminación de enfermedades.

      • Intercambio y almacenamiento de germoplasma

    2. A medio plazo(3-8 años):

      • variación somatoclonal.

      • Variación gametoclonal.

      • Rescate de embriones.

      • Fertilización in vitro.

      • Cultivo de anteras.

      • Producción de haploides.

    3. A largo plazo (8-15 años):

      • hibridación somática.

      • Híbridos.

      • Líneas celulares mutantes.

      • Transferencia de orgánulos.

      • Transferencia de genes/ cromosomas.

      • Metabolitos.



        • Embriogénesis en dicotiledóneas:


    Figura: Embriogénesis en Capsella bursa-pastoris, Dicotiledónea


    La embriogénesis es el resultado de la expresión diferencial de genes; ya desde el cigoto, la dinámica diferencial del calcio marcará la polaridad que inducirá una división asimétrica.

    El cigoto se divide transversalmente en 2 células:



    • la célula micropilar o basal que se divide transversalmente repetidas veces para formar el suspensor.

    • la célula calazal o terminal que se divide verticalmente.

    En el suspensor se puede distinguir: una célula basal, la más cercana al micrópilo, muy grande, vacuolada, con una extensa red de proyecciones parietales, que participa en la nutrición del embrión, y varias células calazales que pronto degeneran. La célula basal vive un poco más pero finalmente desaparece. La célula interna se diferencia en hipófisis. A medida que crece el suspensor empuja hacia adentro al embrión, hacia el tejido nutricio que se está formando.

    En las células derivadas de la célula calazal ocurre otra división vertical, en un plano perpendicular al primero. Luego estas 4 células (cuadrante) se dividen transversalmente formando 8 células (octante). Luego éstas se dividen periclinalmente: el embrión es ahora una estructura globular. Las divisiones siguen hasta que el embrión globular consta de 64 células. En este estado se diferencia la protodermis a partir de las células superficiales.

    Luego las células del embrión inician un programa de divisiones continuadas y morfogénesis para formar los meristemas apicales.  Divisiones laterales localizadas forman 2 prominencias que serán los cotiledones. El embrión adopta así la forma de cuerpo cordiforme; 

    Las divisiones celulares continúan y se alargan cotiledones e hipocótilo. El embrión toma forma de torpedo. Divisiones verticales esbozan el procambium delimitándolo del meristemo fundamental. El crecimiento continúa, los cotiledones alcanzan el polo calazal del saco embrionario y el embrión se curva.

    El meristemo apical, la plúmula, queda localizado entre los cotiledones. El procambium forma el centro del eje hipocótilo-raíz y se extiende a los cotiledones.

    La hipófisis, por una serie de divisiones repetidas contribuye a formar la caliptra y el ápice radical, formándose la radícula separada de los cotiledones y de la plúmula por el hipocótilo.


    ANA PALANCA CUÑADO 2005-2006


    1 No como los esquejados, que dependen de las condiciones ambientales y el tipo de tejido.

    2 Para que enraíce.

    3 Descontrol del ciclo celular.

    4 Masa celular de multiplicación activa.

    5 primeras yemas.

    6 citoplasma con propiedades aptas para la germinación.

    7 Inductor de tumores; de origen bacteriano

    8 así, en un medio selectivo, sólo crecerán las células que hayamos marcado.

    9 O simplemente uno o varios callos que también actúan como biofábricas.


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